Kompartimentierung von GPCR-PKA Signalkaskaden

Aktivierte Membranrezeptoren konvertieren und amplifizieren eingehende Signalinformationen durch intrazelluläre Effektorkaskaden, die zeitlich und räumlich durch vielseitige Strukturproteine organisiert werden. Um zytoplasmatische Effektormoleküle zu rekrutieren, verwenden aktivierte G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) Strukturproteine wie z.B. -Arrestin oder A-Kinase (PKA) Ankerproteine (AKAPs). Dadurch können GTPasen, Kinasen und Phosphatasen physisch mit Rezeptoren verlinkt werden, um dann als Molekularschalter die kontrollierte Weiterleitung von Inputsignalen zu gewährleisten. In einer ersten Machbarkeitsstudie analysierten wir die makromolekulare Organisation von zellulär-kompartimentierten und phosphorylierten PKA Komplexen. Neben bekannten AKAP- Interaktionen konnten wir eine binäre Protein:Proteininteraktion (PPI) zwischen PKA und dem GPCR GPR161 identifizieren. In detaillierten biochemischen Analysen bestätigten wir, dass GPR161, den man hauptsächlich im primären Ziliumkompartiment vorfindet, eine intrinsische AKAP-Funktion aufweist (Bachmann et al, PNAS 2016). In Strukturanalysen werden wir nach einer Erklärung suchen, warum es ausschließlich zu der Isoform-spezifischen Interaktion zwischen GPR161 und dem Typ-I PKA Holoenzym kommt. Zusätzlich zu den Funktionsstudien von Zelllinien, Zebrafischembryonen und deren primäre Zilien starten wir PPI-Reporteranalysen. Unser Ziel ist es die mechanistischen Details, inwieweit GPR161-kompartimentierte PKA Komplexe zusätzliche Rezeptorkaskaden funktionell mitintegriert, zu identifizieren. Zu Beginn steht die Beteiligung der antagonistisch wirkenden Hedgehog-Signalkaskade im Mittelpunkt. Wir nehmen an, dass GPR161 Phosphorylierung und PKA Interaktion wesentliche Faktoren für die präzise Hh-vermittelten Signalweiterleitung in primären Zilien sind. Aufgrund unserer Entdeckung glauben wir, dass zusätzlich zellspezische PKA-Signalosomedie Signaltransmission von GPCR/Kinasekaskaden regulieren und organisieren. Wir haben eine zwei-gleisige Strategie entworfen und kombinieren Affinitäts-Aufreinigungen aus Krebszellen mit Bioinformatikanalysen, um die Details der Organisation von makromolekularen PKA Komplexen zu verstehen. Eine Auswahl potentieller PKA- Interaktoren und Substrate wird in biochemischen und funktionellen Studien auf ihre Funktion hin untersucht, welche relevant sein könnten für GPCR, cAMP- und PKA beteiligte Erkrankungen.

Die Kompartimentierung von Signalmolekülen koordiniert die zelluläre Signalweiterleitung. Das primäre Zilium erfüllt hierbei eine Schlüsselfunktion, indem es für die Signaltransduktion, als räumlich und zeitlich begrenzte Signalplattform fungiert. Für die Integrität der ziliaren Signalübertragung ist es zwingend erforderlich, dass die beteiligten Signalwege durch sogenannte 'Second Messenger Moleküle' sowie durch die An- oder Abwesenheit ihrer Effektor-komplexe reguliert werden. Ziliare G-Protein-gekoppelte Rezeptorkaskaden (GPCR) steuern die Mobilmachung von cAMP, einem evolutionär konserviertem Schlüsselmolekül der Signaltransduktion. Im Zilium-kompartiment dienen für die Signalweiterleitung Proteinkinase A (PKA)-Komplexe als Effektoren von cAMP-Gradienten. In diesem Zusammenhang sind die lokal begrenzten Aktivitäten von sogenannten PKA-Signalosomen, für die basale Hemmung der vielfach pathologisch auftretenden Hedgehog (Hh)-Signalübertragung, unerlässlich. In diesem Projekt haben wir neben Schlüsselaspekten der zugrundeliegenden Signalkreisläufe, die Kompartimentierung von Second Messenger Molekülen und die Beteiligung von Kinase-interagierenden GPCRs analysiert. Zuerst konnten wir zeigen, dass ein makromolekularer und im Zilium lokalisierter Signalkomplex, bestehend aus dem GPCR Gpr161 und der PKA, an der Regulation von Hh-Signalkaskaden beteiligt ist. Dieses Kinase-Signalosom könnte als Angriffspunkt dienen, um fehlgeschalteter Hh-Signalweiterleitung, wie es z.B. wie bei Krankheiten wie Krebs vorkommt, entgegenzuwirken. Zweitens haben wir mit Hilfe von zell-basierten Reporteranalysen und Phospho-Proteom-Messungen neue Wechselwirkung von Kinasen und dem Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) identifiziert. Wir konnten zeigen, dass eine cAMP-Erhöhung die Zilien unterschiedlich beeinflusst. PKA-Substrate scheinen in diesem Zusammenhang zur Zilienbildung und dessen Abbau beizutragen. In diesem Fall besteht das entsprechende Signalosom aus einem multimeren Proteinkomplex, der zwei Kinasen und das UPS umfasst. Die kompartimentierten Enzymaktivitäten tragen hierbei zur Ziliogenese bei. Drittens haben wir grundsätzliche Aspekt von Kinase-Regulation auf molekularer Ebene analysiert. Mit Hilfe neu entwickelter Kinase-Biosensoren und etablierten Reportern für die GPCR-Aktivierung haben wir die Gpr161-Signalübertragung und allgemeine Konzepte der zellbasierten Kinase-Regulation charakterisiert. Insgesamt haben wir neue Beispiele dafür entdeckt, wie kompartimentierte Enzymplattformen durch post-translationale Modifikationen und bioaktive Moleküle, wie es Kinasehemmer sind, kontrolliert und verändert werden. Diese molekularen Einblicke in die Mechanismen binärer Kinase-Interaktionen bieten nun neue pharmakologische Ansatzpunkte, um pathologischen Rezeptor- und Effektor-Wegen entgegenzuwirken.