Strukturelle und funktionelle Analyse von SPOC-Domänen

Transkription durch RNA Polymerase II (Pol II) ist ein sehr dynamischer und komplexer biologischer Prozess, bei dem DNA in mRNA umgeschrieben wird. Pol II-Transkription passiert in drei Schritten: Initiation, Elongation und Termination. Jeder Schritt ist streng reguliert, um eine zeitgerechte und effiziente Produktion von mRNA sicherzustellen, was für spezifische zelluläre Funktionen notwendig ist. Die C- terminale Domäne (CTD) von Pol II besteht aus zahlreichen Wiederholungen des Heptapeptids YSPTSPS, in dem fünf von sieben Aminosäuren durch Phosphorylierung modifiziert werden können. Frühe Stadien der Transkription sind durch pSer5 gekennzeichnet, was essentiell für mRNA-Capping ist, während produktive Elongation durch den Rückgang von pSer5 und Anstieg von pSer2, das für RNA-Prozessierung und Transkriptionstermination notwendig ist, charakterisiert ist. Viele Transkriptionsregulatoren werden zur Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, indem sie entsprechend ihrer regulatorischen Funktion an CTD- Modifizierungen binden. An CTD-spezifischen Interaktionen sind positiv geladene Aminosäuren, die Phospho-Gruppen erkennen, sowie aromatische Aminosäuren, welche die Bindung durch hydrophobe Interaktionen stabilisieren, beteiligt. Kürzlich haben wir SPOC als neue Pol II CTD-Bindedomäne mit Spezifizität für pSer2 identifiziert, die im humanen PHD Finger Protein 3 (PHF3) vorkommt. Die Röntgenkristallstruktur zeigt, dass zwei pSer2-Gruppen in benachbarten CTD-Heptapeptiden durch zwei positiv geladene Bereiche auf der SPOC Oberfläche verankert werden, was darauf hindeutet, dass PHF3 mit RNA Polymerase II interagiert, während diese RNA transkribiert. Das erste wesentliche Ziel dieses Projekts ist es, diese Beobachtung auf SPOC-Domänen anderer Proteine auszuweiten und festzustellen, ob diese ebenso die CTD binden können. Wir werden ihre Bindungspräferenzen für CTD-Peptide analysieren und den Bindungsmodus zwischen den SPOC-Domänen und der CTD mittels Röntgenkristallographie aufklären. SPOC-Domänen werden in Proteinen gefunden, die in Transkriptionsrepression und Entwicklung involviert sind. Die funktionelle Analyse von PHF3 in Zellen, in denen PHF3 durch Knockout abgeschaltet oder seine SPOC-Domäne deletiert ist, zeigte, dass PHF3 als negativer Regulator der Pol II-Transkription agiert und dass SPOC für diese Funktion essentiell ist. Das zweite Ziel dieses Projekts ist es daher, den Mechanismus der Transkriptionsrepression durch PHF3 aufzuklären. Dazu werden wir PHF3 in voller Länge sowie bovinen Pol II-Komplex aufreinigen, um mittels Kryo-Elektronenmikroskopie und Cross-Linking Massenspektrometrie ein umfassendes Bild der Interaktion zwischen PHF3 und Pol II zu gewinnen. Weiters werden wir in vitro-Transkriptions-Assays durchführen, um zu testen, ob PHF3 Pol II-Elongation direkt inhibiert. Abschließend werden wir mittels Chromatin-Immunopräzipitation untersuchen, ob PHF3 andere Transkriptionsfaktoren von der Elongationsmaschinerie verdrängen kann. SPOC-enthaltende Proteine sind an Entwicklungsprozessen beteiligt und in verschiedenen Krebsarten mutiert. Unsere strukturelle und funktionelle Charakterisierung von SPOC als neue Pol II CTD-bindende Domäne wird das Verständnis des Transkriptionsregulations-Mechanismus durch SPOC-enthaltende Proteine vertiefen und helfen zu ergründen, wie ihre Deregulation zu Krankheiten führt.

Transkription durch RNA Polymerase II (Pol II) ist ein dynamischer und komplexer biologischer Prozess, bei dem DNA in mRNA umgeschrieben wird. Pol II-Transkription passiert in drei Schritten: Initiation, Elongation und Termination. Jeder Schritt ist streng reguliert, um eine zeitgerechte und effiziente Produktion von mRNA sicherzustellen, was für spezifische zelluläre Funktionen notwendig ist. Die C-terminale Domäne (CTD) von Pol II besteht aus zahlreichen Wiederholungen des Heptapeptids YSPTSPS, in dem fünf von sieben Aminosäuren durch Phosphorylierung modifiziert werden können. Frühe Stadien der Transkription sind durch pSer5 gekennzeichnet, was essentiell für mRNA-Capping ist, während produktive Elongation durch den Rückgang von pSer5 und Anstieg von pSer2, das für RNA-Prozessierung und Transkriptionstermination notwendig ist, charakterisiert ist. Viele Transkriptionsregulatoren werden zur Transkriptionsmaschinerie rekrutiert, indem sie entsprechend ihrer regulatorischen Funktion an CTD-Modifizierungen binden. Wir haben SPOC als Pol II CTD-Bindedomäne identifiziert, die in den humanen Proteinen PHD Finger Protein 3 (PHF3), Death-Inducer Obliterator (DIDO), RNA Binding Motif Protein 15 (RBM15) und SPEN vorkommt. Biophysikalische Messungen und Röntgenkristallographie-Analysen zeigten, dass PHF3 und DIDO SPOC spezifisch Tandem-pSer2 Modifikationen erkennen, während SPEN und RBM15 SPOC bevorzugt an pSer5 binden. Für DIDO und PHF3 ist das SPOC-abhängige Erkennen von pSer2 CTD essentiell für ihre Rekrutierung zum Pol II-Elongationskomplex, währen RBM15 und SPEN zusätzlich mit den Schreibe- und Leseproteinen von m6A, der häufigsten RNA-Modifikation, interagieren. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass SPOC-Domänen als vielseitiges Phosphoserin-Bindemodul dienen, um die Co-Regulierung von Transkription und RNA Metabolismus zu unterstützen. Tiefgreifende funktionelle Analysen unter Verwendung von CRISPR/Cas9 Genom-Editierung und funktioneller Genomik (z.B. RNA-seq, PRO-seq, SLAM-seq, ChIP-seq) in humanen Zellen in Kombination mit biochemischen Rekonstitutions-Experimenten zeigten, dass sich PHF3 mit Pol II entlang von Genen bewegt und Cluster mit repressiven Pol II Komplexen in Zellen formt. Als Elongationsfaktor moduliert PHF3 Pol II Pause Release und Elongationsrate. In Abwesenheit von PHF3 werden Transkripte stabilisiert, was darauf hindeutet, dass PHF3 RNA-Stabilität negativ reguliert. Die Entfernung der SPOC-Domäne rekapituliert den Phänotyp, den man bei komplettem Verlust des Proteins beobachten kann, was darauf hinweist, dass die SPOC-Domäne maßgeblich für die Verankerung von PHF3 an der Pol II Transkriptionsmaschinerie ist. PHF3 reguliert neuronale Genexpression in differenzierten Zellen und während der neuronalen Differenzierung von Stammzellen. Embryonale Stammzellen der Maus, denen Phf3 fehlt, können wegen frühzeitiger Dereppression von Schlüsselfaktoren, die das neuronales Schicksal der Zellen regulieren, nicht zu Neuronen differenzieren. Angesichts der Tatsache, dass PHF3 als neues Autismus-Risikogen identifiziert wurde und dass seine Expressionslevel in Gliobastomen, einer undifferenzierten Form von Gehirntumoren, reduziert sind, ist die PHF3-mediierte Regulierung neuronaler Genexpression und Differenzierung eine hochrelevante Erkenntnis. Weiters wurden PHF3-Mutationen in Patienten mit neurologischen Entwicklungsstörungen wie Microzephalie identifiziert. Unsere zukünftige Arbeit wird darauf abzielen, aufzuklären, wie Mutationen in PHF3 zu neuronalen Störungen beitragen und wie verminderte PHF3-Expression zur Entstehung und zum Fortschreiten von Glioblastomen beiträgt.