Dynamik von CaV1.2 Kalziumkanälen in neuronaler Modulation

In Neuronen regulieren L-Typ Kalziumströme durch Spannungs-aktivierte CaV1.2 Kanäle die Regulation von Genen und sind für die synaptische Plastizität von Bedeutung. Es ist allerdings umstritten, ob neuronale Aktivität oder die Aktivierung von G-Protein Rezeptoren die Expression von CaV1.2 Kalziumkanälen beeinflussen. Strukturelle und funktionelle Interaktionen von CaV1.2 und dem beta2-adrenergen Rezeotor (b2AR) sind nachgewiesen. Weiters geht die Desensitivierung des b2AR mit der Rezeptorendozytose einher. Jüngst wurde auch die Aktivitäts-induzierte Endocytose von CaV1.2 Kanälen nachgewiesen; die zugrundeliegenden Mechanismen sind allerdings noch unbekannt. Daher stellen wir hier die Hypothese auf, dass b2AR und CaV1.2 in einem gemeinsamen Signalkomplex in Dendriten von hippocampalen Neuronen vorkommen, und dass die anhaltende Aktivierung des b2AR zum gemeinsamen Abbau des Rezeptors und des Kalziumkanals mittels Clathrin-mediierter Endocytose führt. Diese Fragen sollen mittels zweier mikroskopischer Analysemethoden in kultivierten hippocampalen Neuronen, die mit extrazellulär markierten Kalziumkanälen transfizert wurden, beantwortet werden: 1. Hoch-auflösende Immunfluoreszenz Lokalisation von membranständigen CaV1.2-HA; eine Methode, die von der Antragstellering jüngst etabliert wurde, um die Größe und Dichte von CaV1.2 Aggregaten in Dendriten von hippocampalen Neuronen zu eruieren. 2. Die FRAP Technik, zur Analyse der Dynamik von Kalziumkanälen in der Plasmamembran. Um mit dieser Methode ausschließlich membranständige Kanäle zu analysieren, und um die laterale Diffusion vom Neueinbau von Kanälen zu unterscheiden, soll ein Kanal-Konstrukt erzeugt werden, welches extrazellulär ein pH-sensitives GFP trägt. Mittels dieser Methoden können die Verteilung und Größe von Kanal-Aggregaten, sowie die laterale Diffusion, der turn-over und Abbau von CaV1.2 mittels Endocytose analysiert werden. Diese Parameter sollen in ruhenden Neuronen, sowie in Neuronen, die mit verschiedenen physiologischen und pharmakologischen Protokollen aktiviert wurden untersucht werden. Vor allem soll damit untersucht werden, inwiefern die Dynamik von L-Typ Kalziumkanälen durch die Aktivierung der b2AR mit Isoproterenol beeinflusst wird. Postsynaptische L-Typ Kalziumkanäle regulieren die Genexpression in Neuronen und spielen eine essentielle Rolle in jenen Prozessen, die Langzeitgedächtnis generieren. Zu bestimmen, inwiefern die Expression von CaV1.2 Kanälen in der Zellmembran selbst durch neuronale Aktivität reguliert werden und wie dies geschieht, ist von großer Bedeutung um die molekularen Mechanismen von Lernen und Gedächtnis zu entschlüsseln. Die innovativen fluoreszenzmikroskopischen Verfahren, die in diesem Projekt zum Einsatz kommen sollen, versprechen völlig neue Informationen zur Dynamik von Kalziumkanälen und deren möglicher Veränderung bei neuronaler Aktivität.