Identifikation neuer Cofaktoren von DAF-16

Der Insulin/IGF-1-Signaltransduktionsweg (IIS) ist in etablierten Modellorganismen hoch konserviert, reguliert frühe entwicklungsbiologische Prozesse und ist in der Streßabwehr und im Alterungsprozeß eines Organismus involviert. Der Transkriptionsfaktor DAF-16 aus der "Forkhead box O-class" (FOXO-class) determiniert die vom IIS regulierte Genexpression in Caenorhabditis elegans. Zu den Zielgenen von DAF-16 gehören eine Anzahl von Genen, die im Alterungsprozeß, in der zellulären Steßabwehr (Hitzeschock und oxidativer Streß) und in der Abwehr von bakteriellen Infektionen eine Rolle spielen. Obwohl alle diese Gene DAF-16 für ihre Expression benötigen, werden einzelne Gruppen dieser Gene unabhängig von einander reguliert. Das Ziel dieses Forschungsprojektes ist es, besser zu verstehen, wie DAF-16 auf der molekularen Ebene den Alterungsprozeß und die organismische Streßabwehr reguliert. Wir postulieren, daß die Unterschiede in der DAF-16- vermittelten Genexpression durch verschiedene, noch nicht identifizierte Cofaktoren verursacht werden. Diese postulierten Cofaktoren würden mit den Komplexen von DAF-16 interagieren, um sein transkriptionelles Potenzial für die einzelnen Zielgene unterschiedlich zu regulieren. In dieser Forschungsarbeit sollen Cofaktoren und Proteinkomplexe von DAF-16 mittels eines RNAi-Sceens, der auf Reporter basiert, und mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Im Forschungslabor der Gruppe Dr. Dillin wurde das nukleäre Protein SMK-1, ein homologes Protein des aus Säugetieren stammenden SMEK-1, als Cofaktor von DAF-16 identifiziert. Dieses Protein ist essentiell für die Verlängerung der Lebensspanne unter niederregulierten IIS-Bedingungen und vermittelt bestimmte Formen der Streßabwehr. Unter Verwendung einer auf Reporter-basierenden RNAi-Technik werden wir nach SMK-1- ähnlichen Faktoren von DAF-16 und nach Aktivatoren und Repressoren von DAF-16 screenen. Außerdem werden wir mittels Massenspektrometrie transkriptionelle Komplexe, die die Langlebigkeitsfunktion von DAF-16 vermitteln, identifizieren. Dazu werden Immunopräzipitate von "getaggten" DAF-16-Varianten, die in transgenen Würmern exprimiert werden, mit Massenspektrometie analysiert. Die identifizierten, mit DAF-16 interagierenden Kandidaten werden anschließend mit den im RNAi-Screen erhaltenen, potenziellen Faktoren für Langlebigkeit verglichen. Schließlich werden wir auf C. elegans basierende, genetische Analysen verwenden, um die Funktionen der identifizierten Proteine im IIS zu verifizieren und zu charakterisieren. Wir sind der Meinung, daß dieses Forschungsprojekt zu einem tieferen Verständnis der transkriptionellen Mechanismen, die die Langlebigkeits- und Streßabwehrfunktionen von DAF-16 determinieren, beitragen wird.