Zebrafisch als Modellsystem der elektromechanischen Kopplung

Um tiefer in die Struktur - Funktionsbeziehung der elektromechanischen Kopplung (EMK) des Skelettmuskels (d.h., der Umwandlung des elektrischen Membrandepolarisationssignals in die Muskelkontraktion) eindringen zu können, wollen wir den Zebrafisch (Danio rerio) als Modellsystem für diese Forschungsrichtung etablieren. // Der Zebrafisch hat mehrere außergewöhnliche Eigenschaften, die ihn zu einem perfekten Modellorganismus für wissenschaftliche Untersuchungen macht. Neben seiner Robustheit, seiner hohen Vermehrungsrate und kurzen Generationszeit, der relativen Einfachheit transgene Tiere zu erzeugen, ist wohl sein größter Vorteil, dass eine enorme Anzahl an Mutanten existiert. Darunter sind auch Mutationen, die die Motilität des Skelettmuskels betreffen. Es gibt massive Hinweise auf die Existenz einer bewegungsunfähigen Mutante der ein zentrales strukturelles Element der EMK fehlt, nämlich der spannungsabhängige L-typ Ca2+ Kanal oder Dihydropyridinrezeptor (DHPR) der Muskelzellmembran. Dieser DHPR stellt den sog. "Spannungsfühler" dar, der die Membrandepolarisation "fühlt" und dieses Signal an einen anderen, intrazellulären Ca2+ Kanal, den Ryanodinrezeptor (RyR) weiterleitet der daraufhin Ca2+ aus intrazellulären Ca2+ Speichern entlässt - der initiale Schritt der Muskelkontraktion. Unser Ziel ist nun in diese DHPR-lose Zebrafischmutante molekularbiologisch veränderte DHPRs einzubringen um dann diese transgenen Zebrafische sowohl in exakt überwachten Schwimmexperimenten als auch mit biophysikalischen und immunohistochemischen Methoden im Hinblick auf induzierte Abweichungen vom Zebrafisch Wildtyp zu charakterisieren. Eine der derart studierten DHPR Mutanten erzeugt im Menschen die maligne Hyperthermie (MH), die zu gefährlichen Narkosezwischenfällen führen kann. Das erklärt, dass ein MH Modellorganismus von höchster Bedeutung sein wird. Der zweiten untersuchten DHPR Mutante fehlt eine Region, der von anderen Autoren eine essentielle Rolle bei der EMK zugeschrieben wurde. Nachdem wir in einer DHPR- losen Mäusezelllinie nach Expression dieser Mutante keinen Effekt auf die EMK finden konnten, wollen wir dies nochmals - am Gesamttier - untersuchen. Unser dritter geplanter Zebrafisch soll einen DHPR tragen, der von einem chemischen "Crosslinker" erkannt werden soll. Dabei benützen wir den transgenen Fisch zur Massenexpression dieses "bindbaren" DHPRs. Zusätzlich wollen wir auch noch schon vorhandene Zebrafisch Motiltätsmutanten auf DHPR Mutationen hin untersuchen um hier möglicherweise noch unbekannte Defekte der EMK zu entdecken.

Der Zebrafisch (ZF) hat sich in den letzten Jahren als vorteilhafter Modellorganismus für die biomedizinische Forschung etabliert. Unsere Ergebnisse präsentieren nun den ZF als ein wertvolles System um auch die elektromechanische Kopplung (EMK) im Skelettmuskel zu studieren. Unter EMK wird die Transformation einer Membrandepolarisation zur Muskel-kontraktion verstanden. Dabei wirkt der L-Typ Ca2+ Kanal oder Dihydropyridinrezeptor (DHPR) der Plasmamembran als Spannungsfühler, der seine Konformationsänderungen direkt an den Ryanodinrezeptor (RyR1) des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) weitergibt, wodurch Ca2+ aus SR Speichern freigesetzt wird, was schließlich durch Aktivierung der Proteine des Sarkomers zur Kontraktion der Muskelfaser führt. Für diese allosterische DHPR-RyR1 Interaktion ist ein direkter Kontakt des RyR1 mit vier DHPRs in einer sogenannten Tetrade essentiell. // Durch Experimente am gelähmten ZF relaxed konnten wir zeigen, dass i) die DHPR Untereinheit (UE) ß1a für diese Tetradenformation verantwortlich ist. In dieser ß1 -null Mutante relaxed waren ii) nur ~50% der porenbildenden DHPR a 1S UE in der Membran expremiert und diese waren iii) als Spannungsfühler inaktiv. Durch Transfektion von relaxed Myotuben mit ß1a cDNA gelang es uns sowohl die DHPR Funktion als Spannungsfühler als auch die Tetradenformation, und somit die EMK, voll zu rekonstituierten. Zusätzlich gelang es, durch Zygoten-Mikroinjektion von ß1a cRNA den bewegungsfähigen Phänotyp vorübergehend auf relaxed Larven zu übertragen. Mit diesen beiden Expressionssystemen eröffnen sich für uns nun alle Möglichkeiten des Studiums chimärer und punktmutierter ß-Konstrukte im Skelettmuskel in-vitro und in-vivo um Struktur-Funktionsbeziehungen der Pkte i)-iii) zu analysieren. // Überraschenderweise zeigt der ZF DHPR keine Ca2+ Leitfähigkeit und fungiert damit rein als Spannungssensor und allosterischer Signaltransmitter zum RyR. Dies ist damit der erste in-vivo Beweis, dass skelettmuskelartige EMK unabhängig vom Einstrom extrazellulären Ca2+ funktioniert! Biophysikalische Studien an Chimären und Punkmutanten konnten eine einzelne geladene Aminosäure (D636) in der die Kanalpore bildenden a 1S SU identifizieren, die genügt, die Ca2+ Leitfähigkeit auch im Säuger DHPR zum Erliegen zu bringen. Diese Ergebnisse erachten wir nicht nur als wichtigen Beitrag zum Verständnis der Ca2+ Kanal Porenfunktion, sondern auch als wichtiges tool den bisher unverstandenen Ca2+ Einstrom während der EMK zu analysieren. Sowohl eine entsprechende knock-in Maus, als auch ein transgener ZF, der einen leitenden Ca2+ Kanal tragen wird, sind gerade in Entstehung. Von beiden Tiermodellen erhoffen wir tiefere Einblicke in die Rolle des extrazellulären Ca2+ Einstroms während der EMK und damit ein besseres Verständnis der Bedeutung eines ausgewogenen Ca2+ Haushaltes für die Muskelleistung. // Die angestrebte Aufdeckung molekularer Regionen der ß1a UE die für die Integration der porenbildenden DHPR a 1S in Membran und Tetraden verantwortlich sind, als auch von ß-Regionen die sogar die zentrale DHPR Funktion als Spannungsfühler modulieren, lässt die Entwicklung ß-selektiver Medikamente erhoffen. Sollten diese Regionen sogar spezifisch für die ß-Isoformen des Skelettmuskels, Herzens und Gehirns sein, wäre die Entwicklung einer neuen Generation von auf Expressionsebene wirkender Ca2+ Antagonisten vorstellbar.