Fukosylierung und Defukosylierung in A. thaliana

Thema 1, a1,2-Fucosyltransferasen: Es sollen die cDNAs für die Xyloglucan a1,2-Fucosyltransferase Homologe aus A. thaliana kloniert und exprimiert werden. Die rekombinanten Proteine werden auf ihre enzymatische Aktivität getestet. Potentielle Promotor Sequenzen der 10 Mitglieder der Xyloglucan Fucosyltransferase Familie sollen kloniert und zur Bestimmung ihrer zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster verwendet werden. Die Wirkung biotischer und abiotischer Stressfaktoren und von Hormonen auf die Expressionsmuster der potentiellen Fucosyltransferasen wird untersucht werden. Die Untersuchung des Phenotyps von Mutanten soll mit besonderer Berücksichtigung der Entwicklungsphase und des Gewebes erfolgen, in dem die Promotorstudien im Wildtyp Genexpression gezeigt haben. Für diese Stadien und Organe sollen biochemische und elektronenmikroskopische Analysen der Zellwandkomponenten durchgeführt werden. Thema 2, a1,2-Fucosidase: Diese Fukosidase wurde kürzlich in unserer Gruppe identifiziert und ihre Aktivität auf Xyloglucane gezeigt. Die Aktivitätsbestimmung soll auf Arabinogalactane und Rhamnogalacturonane ausgedehnt werden. Die Genexpression soll durch Promotorstudien, die Enzymverteilung durch Western Blot und die subzelluläre Lokalisierung durch Elektronenmikroskopie mithilfe dafür erzeugter Antikörper untersucht werden. Ausgehend von den hierbei erhaltenen Ergebnissen sollen die Xyloglucan-Strukturen in den relevanten Geweben und Entwicklungsstadi im Wildtyp und in Mutanten untersucht werden. Die Wirkung von Phytohormonen und des Nonasaccharids XXFG auf Mutanten und Wildtyp wird untersucht werden. Die a1,2-Fucosidase soll unter der Kontrolle des 35S Promotors via Agrobacterium Transformation überexprimiert werden. Die Wirkung auf Xyloglucan-Strukturen soll mittels Massenspektroskopie nach Verdau mit Endo-(1,4)-ß-D-Glucanase analysiert werden. Der Phänotyp der überexprimierenden Mutante soll während des Wachstums unter Normalbedingungen sowie unter Hormonstreß beobachtet werden. Thema 3, a1,3/4-Fucosidase: Der A. thaliana a1,3/4-Fucosidase Promotor wird mithilfe eines Fusionskonstruktes untersucht um eine allfällige Übereinstimmung mit dem Expressionsmuster von N-Glycanen mit Lewis a Determinanten zu erkennen. Western Blot und Immunlokalisierung sollen in verschiedenen A. thaliana Geweben durchgeführt werden. Dazu wird ein polyklonaler Antikörper mittels in E. coli exprimierter, rekombinanter a1,3/4- Fucosidase erzeugt. Das N-glycan Profil einer Mutante soll mit dem des Wildtyps verglichen werden.

Thema 1, a1,2-Fucosyltransferasen: Es sollen die cDNAs für die Xyloglucan a1,2-Fucosyltransferase Homologe aus A. thaliana kloniert und exprimiert werden. Die rekombinanten Proteine werden auf ihre enzymatische Aktivität getestet. Potentielle Promotor Sequenzen der 10 Mitglieder der Xyloglucan Fucosyltransferase Familie sollen kloniert und zur Bestimmung ihrer zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster verwendet werden. Die Wirkung biotischer und abiotischer Stressfaktoren und von Hormonen auf die Expressionsmuster der potentiellen Fucosyltransferasen wird untersucht werden. Die Untersuchung des Phenotyps von Mutanten soll mit besonderer Berücksichtigung der Entwicklungsphase und des Gewebes erfolgen, in dem die Promotorstudien im Wildtyp Genexpression gezeigt haben. Für diese Stadien und Organe sollen biochemische und elektronenmikroskopische Analysen der Zellwandkomponenten durchgeführt werden. Thema 2, a1,2-Fucosidase: Diese Fukosidase wurde kürzlich in unserer Gruppe identifiziert und ihre Aktivität auf Xyloglucane gezeigt. Die Aktivitätsbestimmung soll auf Arabinogalactane und Rhamnogalacturonane ausgedehnt werden. Die Genexpression soll durch Promotorstudien, die Enzymverteilung durch Western Blot und die subzelluläre Lokalisierung durch Elektronenmikroskopie mithilfe dafür erzeugter Antikörper untersucht werden. Ausgehend von den hierbei erhaltenen Ergebnissen sollen die Xyloglucan-Strukturen in den relevanten Geweben und Entwicklungsstadi im Wildtyp und in Mutanten untersucht werden. Die Wirkung von Phytohormonen und des Nonasaccharids XXFG auf Mutanten und Wildtyp wird untersucht werden. Die a1,2-Fucosidase soll unter der Kontrolle des 35S Promotors via Agrobacterium Transformation überexprimiert werden. Die Wirkung auf Xyloglucan-Strukturen soll mittels Massenspektroskopie nach Verdau mit Endo-(1,4)-ß-D-Glucanase analysiert werden. Der Phänotyp der überexprimierenden Mutante soll während des Wachstums unter Normalbedingungen sowie unter Hormonstreß beobachtet werden. Thema 3, a1,3/4-Fucosidase: Der A. thaliana a1,3/4-Fucosidase Promotor wird mithilfe eines Fusionskonstruktes untersucht um eine allfällige Übereinstimmung mit dem Expressionsmuster von N-Glycanen mit Lewis a Determinanten zu erkennen. Western Blot und Immunlokalisierung sollen in verschiedenen A. thaliana Geweben durchgeführt werden. Dazu wird ein polyklonaler Antikörper mittels in E. coli exprimierter, rekombinanter a1,3/4- Fucosidase erzeugt. Das N-glycan Profil einer Mutante soll mit dem des Wildtyps verglichen werden.