T. reesei Xylanase Expression: Unterschiedliche Induktoren

Filamentöse Ascomyceten der Gattung Trichoderma sind hauptsächlich Saprophyten mit der Fähigkeit Biopolymere pflanzlichen Ursprungs, wie Cellulose und Hemicellulose abzubauen. Hemicellulose kann dabei als ein Oberbegriff für eine Vielzahl von Heteropolysacharieden verstanden werden die entweder aus einem Rückgrad aus Xylose- (Xylan) oder aus Mannoseresten (Mannane, Glukomannane) aufgebaut sind welches mit Seitenketten aus Arabinose-, Galactose-, Essigsäure und/oder Glucuronsäureresten versehen ist. Hemicellulosen sind weitgehend wasserunlöslich und daher stellt deren Hydrolyse eine wesentliche Herausforderung für Saprophyten dar. Für einen vollständigen Abbau von Hemicellulosen ist eine große Anzahl unterschiedlichster Enzyme notwendig die in synergistischer Wirkungsweise einen Abbau zu kleineren Oligosacharieden und schließlich zu den entsprechenden Monomeren ermöglichen. In der Aufklärung der Regulation der Produktion von Hemicellulasen in filamentösen Pilzen hat Trichoderma gemeinsam mit Aspergillus eine führende Rolle. Wesentliche Fortschritte wurden dabei in den letzten Jahren sowohl bei der Identifikation der in cis agierenden Elemente als auch der in trans wirkenden Faktoren erzielt. In Trichoderma dürfte die Wirkung des Hauptregulators der Hydrolaseexpression (Xyr1) direkt durch das Einwirken weiterer spezifischer Transkriptionsfaktoren (e.g. Ace1 and Ace2) moduliert werden. Wenn auch die Bindungselemente in den Promotoren der beiden wichtigsten xylanolytischen Gene weitgehend ähnlich sind konnten wir kürzlich zeigen, dass nur jeweils ein Faktor in die Transkriptosomausbildung eingreift (i.e. Ace1 in die des xyn1 Gens, und Ace2 in die des xyn2 Gens). Erste Untersuchungen lieferten dabei hinweise auf eine Vielzahl von Mechanismen die in die Modifikation des xyn1 bzw. xyn2 Transkriptosoms eingreifen. Starke Indizien liegen dabei für den Einfluss von Phosphorylierungsschritten, von direkter Kommpetition sowie für Homo- bzw. Heterodimerausbildung der beteiligten Transkriptionsfaktoren vor. Derzeit besteht ansatzweise eine modellhafte Vorstellung über den Aufbau sowie die Funktionsweise der beiden Transkriptosome, ein detailliertes Verständnis des Wechselspiels der Signale und Faktoren ist aber nach wie vor nicht gegeben. Um konkrete Einblicke in die Organisation der Transkriptionsmaschinen der Xylanase I und II von Trichoderma reesei zu erlangen sollen in diesem Projekt folgende wissenschaftlichen Fragestellungen beantwortet werden: i) wird Ace1 modifiziert um seine aktive Form zu erlangen, welche Rolle spielt dabei das Ace1 interagierende Protein (Aip)? ii) Bindet Ace1/Aip an Xyr1 unter Ausbildung eines Heterodimers oder wird die Repressorwirkung durch ein Verdrängen des Xyr1 Induktionskomplexes erreicht? iii) ist eine Homodimerisierung von Xyr1 die Voraussetzung für eine xyn1 Induktion? iv) Bildet Ace2 ein Heterodimer mit Xyr1 aus? v) Welche Modifikationen bzw. Interaktionspartner führen zur Modulierung des Ace2/Xyr1 - DNA Komplexes um die unterschiedlichen Stufen der Regulation der xyn2 Expression zu erreichen? vi) Welche unterschiedliche Zusammensetzung eines xyn2 spezifischen Transkriptosoms kann in einen Ace2 Deletionsstamm verglichen mit dem Wildtyp beobachtet werden? vii) Welche unterschiedliche Zusammensetzung des xyn2 spezifischen Transkriptosoms kann bei Anwendung unterschiedlicher Induktoren (Xylobiose und Sophorose) beobachtet werden?

Der filamentöse Ascomycet Trichoderma reesei (T. reesei) ist aufgrund der Fähigkeit Zellulose- und Hemizellulose-abbauende Enzyme zu produzieren und diese in hohem Maße zu sekretieren von großer industrieller Bedeutung. Die von T. reesei produzierten Enzyme werden in zahlreichen industriellen Prozessen der Papier- und Zellstoffindustrie, der Lebens- und Futtermittelindustrie, sowie der Textilindustrie eingesetzt. Außerdem spielen diese Enzyme eine wichtige Rolle in der Herstellung von Bioethanol aus pflanzlichen Reststoffen, wie z.B. Stroh und Holz. Um die Produktion der nativ von T. reesei stammenden Enzyme zu verbessern sowie Ansätze zur Expression von heterologen Proteinen und zur Produktion wichtiger chemische Bausteine für die Industrie in T. reesei voranzutreiben, ist ein detailliertes Verständnis der regulatorischen Prozesse, denen die Expression der hydrolytischen Enzyme unterliegt, essentiell. In den letzten Jahren wurden signifikante Fortschritte erzielt, um die regulatorischen Mechanismen aufzuklären, die die Expression hydrolytischer Enzyme kontrollieren, wie zum Beispiel die Identifizierung von Transkriptionsfaktoren und die Aufklärung von deren Wirkung auf die transkriptionelle Regulation. Untersuchungen zeigten weiters, dass die bis jetzt untersuchten, aktivierenden Faktoren ihre entsprechenden cis regulatorischen Elemente unabhängig von den jeweiligen Wachstumsbedingungen binden. Dies deutet auf weitere spezifische Modifikationen hin, wie zum Beispiel Phosphorylierungs-oder Dimerisierunsprozesse dieser Faktoren, die in weiterer Folge einen Einfluss auf die substratspezifische Induktion haben. Im Hinblick darauf war dieses Projekt der Aufklärung von Induktorspezifitäten bei der Regulation der Xylanaseexpression gewidmet. Die Erkenntnisse, die dadurch gewonnen wurden, helfen dabei das existierende Modell für die Regulation der Xylanaseexpression zu vervollständigen. Damit kann in der Folge die Produktion von maßgefertigten Enzymcocktails für spezielle Anwendungen verbessert und Ansätze zur wirtschaftlichen Erzeugung von Zellulose-Ethanol gefördert werden.