Das große Phosphoprotein des humanen Cytomegalievirus

Eine sichere, schützende und Kosten-effiziente Impfung gegen Cytomegalievirus (CMV) ist eine der höchsten Prioritäten des US Institute of Medicine, begründet auf die ökonomischen Kosten sowie Mortalität und Invalidität die mittels einer erfolgreichen Impfung eingespart werden könnten. Der dringliche Bedarf konnte jedoch trotz intensive Forschung über mehr als 40 Jahre nicht gedeckt werden. Die Mehrzahl der bisher entwickelten CMV Impfungen verwendeten dasselbe CMV Antigen, das Glycoprotein B (gB). Die enttäuschenden bisherigen Ergebnisse könnten für die Verwendung eines anderen CMV Antigens sprechen. Das große Phosphoprotein pUL32 (pp150) ist sehr immunogen und induziert eine humorale und zelluläre Immunität. Dementsprechend könnte pUL32 ein vielversprechender Kandidat für eine neue CMV Impfung sein. Allerdings fanden wir rezent bei diesem Protein Hinweise für Charakteristika eines B-Zell Superantigens und eine Beteiligung in der Entwicklung der chronisch- lymphatischen Leukämie (CLL). Ein verwandtes CMV Antigen (pp65) wurde zusätzlich mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang gebracht. pUL32 hat wahrscheinlich außergewöhnliche strukturelle Eigenschaften von ungeklärter immunologischer Relevanz ausgeprägte Phosphorylierungen wie die meisten anderen immunogenen CMV Tegumentproteine, Glycosylierungen ähnlich immunogener Influenzavirusproteinen und sehr wahrscheinlich keine Tertiärstruktur. Die Erforschung der immunologischen Relevanz dieser Eigenschaften könnte wesentlich zur Klärung der Rolle von pUL32 in der Entstehung von Immunität und Autoimmunität und zu einer Reevaluation des in CMV Impfungen am zweithäufigsten verwendeten Antigens, pp65, führen. Um die immunologische Relevanz dieser außergewöhnlichen Eigenschaften zu klären werden wir pUL32 Protein von Labor- und klinischen CMV Stämmen rekombinant herstellen (r-pUL32), aufreinigen, gezielt posttranslationale Modifikationen verändern und die Immunogenität dieser unterschiedlichen Proteine mittels unterschiedlicher immunologischer Tests (Immunoblots, indirekter ELISA, B-Zell Stimulationstest), Immunseren und monoklonalen Antikörpern beleuchten. Die in silico Vorhersage, dass pUL32 ein intrinsisch unstrukturiertes Protein (IUP) ist wird experimentell mittels NMR Spectroscopy validiert und die Immunogenität des strukturierten mit dem unstrukturierten pUL32 Proteins mittels Co-Expression mit dem natürlichen Liganden, Bicaudal D1, untersucht. Die vorgeschlagene Studie wird wichtiges Verständnis für die Immunbiologie eines der immundominanten CMV Proteine schaffen Wissen, das Basis für ein besseres Verständnis von B-Zell Superantigenen, wegweisend für zukünftige Entwicklung von Impfstoffen und Diagnostika, und die Erforschung der Rolle der CMV Infektion bei der CLL sein kann.

Im Mittelpunkt des vorliegenden Forschungsprojektes war die Aufklärung der Struktur und immunologischen Eigenschaften eines prominenten Cytomegalievirus (CMV) Proteins - das große Phosphoprotein-pUL32 (pp150). Die Gründe für die Untersuchung dieses bestimmten CMV-Proteins waren vielfältig. Ein sicherer, schützender und kostengünstiger Impfstoff gegen CMV-Infektionen ist eine der höchsten Prioritäten des US Institute of Medicine basierend auf den volkswirtschaftlichen Kosten und den Jahre der erforderlichen Lebens- und Berufsunfähigkeitsversicherung die vermieden werden könnte. Ein wirksamer CMV-Impfstoffes konnte jedoch bisher nicht entwickelt werden. pUL32 ist ein hoch immunogenes Virus-Protein, das sowohl humorale und zelluläre Immunität induziert und daher möglicherweise einen potenziellen Impfstoffkandidaten darstellt. Wir fanden jedoch auch Hinweise, dass pUL32 möglicherweise ein B-Zell-Superantigen und eingebunden in die Entwicklung von chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) ist. Das würde das Protein wiederum als Impfstoffkandidaten disqualifizieren. Eine hypothetische Erklärung für diese widersprüchliche Erkenntnisse sind möglicherweise strukturelle Merkmale von pUL32. Das Protein hat wie die meisten anderen immunogen CMV Proteine ausgeprägte Glykosylierungen und Phosphorylierungen. Wir entdeckten jedoch mehrere überraschende Eigenschaften des Proteins: (1) der Status der Phosphorylierung wurde in der Vergangenheit grob überschätzt durch indirekte Annahmen über den Status der Phosphorylierung, (2) der Grund für die Hypophosphorylation ist die Aktivität einer zellulären Phosphatase, die in das Virion verpackt ist, (3) das Protein ist intrinsisch unstrukturierte und erlangt eine Sekundärstruktur nur bei Bindung mit anderen Interaktionspartner, was es (4) unmöglich macht, dieses große Protein als ein großes Molekül aufzureinigen. Diese Erkenntnisse werfen ein völlig neues Licht auf die biologischen, immunologischen und biochemischen Eigenschaften eines wichtige CMV-Antigen.