Regulation und Schaltmechanismus von Orai Kanälen

In T-Lymphozyten und Mastzellen stellen die so genannten Ca 2+ release activated Ca2+` (CRAC) Kanäle den primären Mechanismus dar, der lang - andauernden Erhöhungen des zytosolischen Ca2+ Spiegels unterliegt, welcher durch Speicherentleerung des Endoplamatischen Retikulums (ER) hervorgerufen wird. STIM1, welches den luminalen Ca2+ Spiegel im ER fühlt` und Orai1, das die porenbildende Untereinheit darstellt, bilden die molekularen Hauptbestandteile des CRAC Kanals. Durch Speicherentleerung wird Multimerisierung und eine Umverteilung von STIM1 zur Plasmamembran beobachtet. Die darauf folgende Kopplung von STIM1 an Orai1 initialisiert CRAC Ströme. Mit diesem Projekt möchte ich die Schlüsseldomänen identifizieren, die essentiell für den Schaltmechanismus von Orai1 sind. Einerseits werde ich mich dabei auf den positiven Aminosäurecluster im N-Terminus von Orai1 konzentrieren, der innerhalb der gesamten Orai Familie konserviert ist. Dieser Cluster gleicht einer PIP 2 /PIP3 - Domäne, wie auch einem CRAC (Cholesterol Erkennungs-)-Motif und beinhaltet des Weiteren auch eine Calmodulin-Bindestelle. Mittels eines kombinierten Ansatzes verschiedener Methoden wie Molekularbiologie, Biochemie, Elektrophysiologie, konfokaler FRET Mikroskopie und Kalzium Imaging sollten diese Fragestellungen geklärt werden. Die Zelllinie HEK293 dient dabei als Standard-Expressionssystem. Des Weiteren sollen meine Studien durch high-troughput Analysen von Orai1 Mutanten, generiert durch Zufalls-Mutations-PCR`, komplettiert werden. Dies erleichtert die Identifizierung von zusätzlichen regulierenden Domänen der STIM/Orai1 Signalkaskade. In einem weiteren Schritt möchte ich meine Studien auch auf Orai2 und Orai3 ausdehnen, um deren regulatorische Domänen und Schaltungsmechanismen mit denen von Orai1 vergleichen zu können. Deshalb können meine Resultate einen tieferen Einblick in die molekularen Mechanismen geben, die zur Funktion des CRAC Kanals beitragen. Auf lange Sicht können diese Ergebnisse für die Suche nach therapeutischen Ansätzen von großer Bedeutung sein.